La raccolta, dedicata all’arte sacra, contiene dipinti, paramenti sacri, oreficerie e oggetti religiosi, tra cui la famosa Croce Veliterna, reliquiario insigne dei sec. XI-XII; la Visitazione di Bicci Lorenzo (1435), la Madonna in trono col Bambino di Antoniazzo Romano (1486), la Madonna col Bambino ed Angeli (1426-27) di Gentile da Fabriano, ed alcune parti ornamentali della pianeta di Papa Benedetto XI (fine del XII secolo).

Il Museo Diocesano fa parte, insieme ai Musei Civici, del Sistema Museale Urbano Città di Velletri.